我猜测题主想问的是游戏内容方面的差异，那么绝大部分情况是不会的。因为模拟器执行的是ROM，正常情况这个ROM就是从实体卡带、光盘里dump出来的，从数据上来说它们是完全一样的（当然解密ROM除外），基本不存在模拟器版本这一关boss是春丽，实机版本变成了隆这种情况。
但是模拟器是一种通过代码来模拟硬件的软件，在还原度上，因为代码问题或多或少都有失真，无论是官方的模拟器（即任天堂的VC、索尼PS1/PS2 Classic 或者其他经典游戏的移植版）还是市面上常见的模拟器软件，都会有诸如颜色失真、闪烁、音频问题、特殊芯片无法模拟等情况发生。即便硬件兼容这种并非软件模拟的情况，由于硬件的改变即便能兼容但有时候也是会有差异的，比如GBC玩GB游戏会上色；Super Game Boy 初代的游戏运行速度比实体GB机略快等等。